前言

抗體類(lèi)藥物的研發(fā)日益增多，為了確保這些分子質(zhì)量屬性的準(zhǔn)確描述，需要采用復(fù)雜的技術(shù)手段。質(zhì)譜（MS）由于其優(yōu)于目前現(xiàn)有分析技術(shù)的結(jié)構(gòu)分辨能力，已經(jīng)成為治療性抗體研發(fā)的幾乎必備的分析工具。質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于抗體研發(fā)的各個(gè)階段，包括克隆選擇、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)發(fā)、純化過(guò)程開(kāi)發(fā)、制劑開(kāi)發(fā)、穩(wěn)定性研究和可比性研究。質(zhì)譜確定的結(jié)構(gòu)特征包括氨基酸序列、二硫鍵位置、碳水化合物結(jié)構(gòu)和特征以及許多不同的翻譯后、過(guò)程中和貯存中的修飾。

在本綜述中，我們將討論用于單克隆抗體（mAbs）結(jié)構(gòu)表征的各種基于質(zhì)譜的技術(shù)。在討論mAbs結(jié)構(gòu)表征策略之前，有必要定義本文中使用的一些術(shù)語(yǔ)。通過(guò)質(zhì)譜表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變異或修飾時(shí)，完整分子的質(zhì)量測(cè)量可以呈現(xiàn)出整個(gè)蛋白質(zhì)的一般特征，但不能提供變異或修飾的位置。換句話(huà)說(shuō)，完整分子的質(zhì)量測(cè)量并不能提供任何結(jié)構(gòu)分辨信息。為了獲得結(jié)構(gòu)分辨的信息，需要在進(jìn)行質(zhì)量分析之前將蛋白質(zhì)切割成較小的片段。這種切割過(guò)程可以在溶液中或氣相中進(jìn)行。當(dāng)片段主要在溶液中生成時(shí)，質(zhì)譜儀用于分析每個(gè)片段，分子根據(jù)從這些片段獲得的信息構(gòu)建：我們稱(chēng)這種方法為“up”類(lèi)型方法。另一方面，當(dāng)片段主要在質(zhì)譜儀內(nèi)的氣相中生成時(shí)，質(zhì)譜儀用于直接分析整個(gè)分子，我們稱(chēng)這種方法為“down”類(lèi)型方法。

“up”和“down”方法進(jìn)一步分為“bottom-up”、“middle-up”、“top-down”和“middle-down”方法亞型。方法亞型取決于引入質(zhì)譜儀的分子大小相對(duì)于完整分子的大小。當(dāng)直接將感興趣的完整分子引入質(zhì)譜儀時(shí)，該方法是“top-down”的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在引入質(zhì)譜儀之前被切割成幾個(gè)大片段時(shí)，如果直接測(cè)定這些片段的質(zhì)量，則該方法是“middle-up”的方法；如果在質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的片段化，則為“中間向下”的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在引入質(zhì)譜儀之前被消化成小肽時(shí)，該方法是“middle-down”的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在引入質(zhì)譜儀之前被消化成小肽時(shí)，該方法稱(chēng)為“bottom-up”方法，無(wú)論這些肽是否進(jìn)行MS/MS。這些技術(shù)在結(jié)構(gòu)分辨率、序列覆蓋率、樣品消耗和分析便利性方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。將這些方法應(yīng)用于mAbs結(jié)構(gòu)表征的總結(jié)如圖1所示，將在以下章節(jié)中詳細(xì)討論。

(相關(guān)資料圖)

圖1: 不同的基于質(zhì)譜的技術(shù)用于單克隆抗體的結(jié)構(gòu)表征

02基本概念

2.1儀器分辨率

質(zhì)量測(cè)量的質(zhì)量取決于質(zhì)譜儀的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確性。高分辨率的儀器可以分辨質(zhì)量稍有不同的分子，使它們的質(zhì)量能夠分別確定，而不是作為加權(quán)平均值合在一起。所有天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)都具有普遍的質(zhì)量異質(zhì)性，這來(lái)自不同分子的不同同位素組成以及復(fù)雜發(fā)翻譯后修飾。如果質(zhì)譜儀具有足夠的分辨率，那么這些同位素峰可以分辨，每個(gè)個(gè)體同位素組成的質(zhì)量可以確定。在這些同位素峰中，單一同位素峰是最重要的，因?yàn)樗俏ㄒ痪哂歇?dú)特同位素組成的峰。然而，對(duì)于如mAb這樣的大型蛋白質(zhì)，單一同位素峰是不可觀(guān)察的，同位素分布如此廣泛，以至于難以確定每個(gè)同位素峰中包含多少重穩(wěn)定同位素。因此，同位素峰的精確質(zhì)量用途有限。此外，對(duì)于像mAb這樣大的蛋白質(zhì)，同位素峰很難分辨。由于儀器分辨率與儀器靈敏度之間通常存在折衷，因此評(píng)估質(zhì)量測(cè)定完整mAb的最佳分辨率是有幫助的。圖2顯示了一個(gè)典型的mAb（元素組成為C6600H10172N1738O2103S52）的模擬同位素分布作為分辨率（R=M/DM）的函數(shù)?？梢钥闯?，當(dāng)分辨率在8000以上時(shí)，同位素包絡(luò)峰寬度沒(méi)有顯著改變。盡管當(dāng)分辨率達(dá)到200000時(shí)，同位素峰開(kāi)始分辨，但它們的精確質(zhì)量提供的信息很少，而且在這種高分辨率下，靈敏度會(huì)受到影響。因此，最佳分辨率約為8000-10000。分辨率在10000以上通常不會(huì)有助于分辨任何mAb異質(zhì)性。在自然峰寬（半高處）達(dá)到25 Da的情況下，很難分辨出質(zhì)量變化較小的異質(zhì)性，如氧化（+16 Da），而用任何儀器幾乎不可能分辨出脫酰胺（+1 Da

圖2：典型單克隆抗體元素組成為C6600H10172N1738O2103S52，不同分辨率（R=M/ΔM）的模擬同位素分布。

2.2 質(zhì)量準(zhǔn)確度在一個(gè)分子的許多同位素峰中，單一同位素峰是唯一具有單一同位素組成的峰，因此具有唯一確定的理論質(zhì)量。因此，在評(píng)估較小分子質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確性時(shí)，通常只使用單一同位素峰。然而，對(duì)于像mAb這樣的大分子，同位素峰極難分辨。即使同位素峰被分辨出來(lái)，由于單一同位素峰的豐度幾乎為零，無(wú)法可靠地確定單一同位素質(zhì)量。因此，必須使用抗體的平均質(zhì)量來(lái)確認(rèn)其元素組成。事實(shí)上分子的平均質(zhì)量受到組成該分子的元素的同位素豐度的影響。例如，在重組mAb的生產(chǎn)過(guò)程中，哺乳動(dòng)物（CHO）細(xì)胞被喂養(yǎng)20種氨基酸和一些其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這將確定產(chǎn)出抗體中的同位素豐度。因?yàn)椴煌氐耐凰刎S度主要取決于它們的來(lái)源，因此，應(yīng)該使用不同來(lái)源的元素的原子量來(lái)計(jì)算不同來(lái)源化合物的平均質(zhì)量。表1顯示了蛋白質(zhì)中元素的IUPAC標(biāo)準(zhǔn)原子量和范圍。表1中還顯示了根據(jù)有機(jī)物中這些元素的同位素豐度估計(jì)的原子量及其范圍。在計(jì)算天然蛋白質(zhì)的理論質(zhì)量時(shí)，最好使用有機(jī)來(lái)源元素的原子量，因?yàn)樗鼈兪沁@些分子中元素的主要來(lái)源。例如，對(duì)于元素組成為C6600H10172N1738O2103S52的mAb，其理論質(zhì)量根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)原子量計(jì)算為149181.15 Da。但是，當(dāng)使用根據(jù)有機(jī)來(lái)源估計(jì)的原子量時(shí)，計(jì)算出的理論質(zhì)量為149181.89 Da。這個(gè)差異（0.74 Da）相當(dāng)于mAb的理論平均質(zhì)量差異為5.0 ppm。由于大自然中同位素豐度的變化，蛋白質(zhì)的平均質(zhì)量很容易因?yàn)閹譸pm而發(fā)生變化。例如，碳的原子量變化0.00008 Da（C3代謝過(guò)程的陸生植物范圍的一半）會(huì)導(dǎo)致相同的mAb分子質(zhì)量差異為0.53 Da（3.5 ppm）。類(lèi)似地，其他元素的變化也會(huì)導(dǎo)致分子平均質(zhì)量的低ppm差異（氫為1.6 ppm，氮為1.7 ppm，氧為1.3 ppm，硫?yàn)?.0 ppm）。總體而言，由于天然同位素豐度的變化，mAb的平均質(zhì)量變化范圍在3-5 ppm左右，前提是使用表1右列的有機(jī)來(lái)源元素的平均原子量。表1：常見(jiàn)原子不同來(lái)源的質(zhì)量數(shù)

因此，測(cè)量mAb質(zhì)量的關(guān)鍵因素包括儀器分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確性。對(duì)于大型蛋白質(zhì)如mAb，最佳分辨率約為8000-10000，分辨率在10000以上通常不會(huì)有助于分辨任何mAb異質(zhì)性。質(zhì)量準(zhǔn)確度對(duì)于識(shí)別不同修飾和異質(zhì)性也至關(guān)重要。理想情況下，蛋白質(zhì)質(zhì)量的測(cè)定應(yīng)具有足夠高的準(zhǔn)確性，接近于天然同位素豐度變化所致的平均質(zhì)量變化，從而有助于準(zhǔn)確評(píng)估蛋白質(zhì)的組成和可能的修飾.

近年來(lái)，飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）已在質(zhì)量準(zhǔn)確性（2-10 ppm）、分辨率（5,000-20,000）和最大m/z（高達(dá)10,000）方面取得了顯著成果。當(dāng)分析儀配備ESI時(shí)，這些特點(diǎn)非常適合測(cè)定完整mAbs的質(zhì)量。

早期嘗試使用ESI-TOF進(jìn)行完整mAb質(zhì)量分析的研究受到了當(dāng)時(shí)儀器性能的限制。隨著ESI和TOF技術(shù)的不斷改進(jìn)，ESI-TOF和ESI-Q-TOF已被廣泛認(rèn)為是分析大分子蛋白質(zhì)（如mAbs）質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)儀器。

在ESI-TOF儀器上，使用每日外部校準(zhǔn)，測(cè)定完整mAbs質(zhì)量的質(zhì)量準(zhǔn)確性通常低于100 ppm。通過(guò)仔細(xì)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)，可以將完整mAb的質(zhì)量準(zhǔn)確性測(cè)定為25-50 ppm。在實(shí)驗(yàn)條件下優(yōu)化以減少加合物形成，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行校準(zhǔn)，并嚴(yán)格控制去卷積參數(shù)，部分實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)現(xiàn)接近10 ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確性。

TOF通?？商峁┑淖罡叻直媛时萇rbitrap 和FTICR MS 低幾倍，盡管最近的多通道TOF 分析儀能夠?qū)崿F(xiàn)超高分辨率（在m/z 400 處，R≥100000）。同時(shí)，TOF的分辨率在MS 和MS/MS 模式下基本相同，這在形式上是對(duì)Orbitrap 分析儀的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)镺rbitrap 在MS/MS 模式下常常為了速度而犧牲分辨率。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，TOF在MS/MS 模式下的較高分辨率并不一定能夠轉(zhuǎn)化為更高的質(zhì)量精度（這通常是最理想的分析參數(shù)），因?yàn)門(mén)OF 的傳輸效率受到限制。因此，與TOF 相比，在類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中，Orbitrap質(zhì)譜儀實(shí)際報(bào)告的真正陽(yáng)性識(shí)別率可能更高。

峰值檢測(cè)限由信號(hào)/噪聲比確定，由于檢測(cè)器的暗電流、漂移離子以及“化學(xué)”背景離子的存在，TOF的噪聲會(huì)增加。這些非共價(jià)的復(fù)合物由分析物離子、溶劑和有時(shí)還有氣態(tài)分子組成，其電荷通常來(lái)自于質(zhì)子以外的堿金屬和其他附加物。這些非共價(jià)復(fù)合物在每個(gè)m/z單位處產(chǎn)生寬而模糊的峰，其峰谷由類(lèi)似來(lái)源的多帶電離子和其亞穩(wěn)解離產(chǎn)物填充。這種化學(xué)背景的存在通常是限制TOF儀器檢測(cè)閾值和動(dòng)態(tài)范圍的主要因素。有點(diǎn)諷刺的是，使用FT分析器（包括FTICR和Orbitrap）獲得的質(zhì)譜圖幾乎不含有化學(xué)背景。這種現(xiàn)象的可能解釋是，要被檢測(cè)到（即使是在錯(cuò)誤的m/z處），背景離子只需要進(jìn)入TOF分析器，之后就可以由于碰撞而解離或偏離其路徑，而這兩個(gè)事件都不會(huì)顯著影響檢測(cè)概率。同時(shí)，在FT質(zhì)譜圖中產(chǎn)生一個(gè)尖銳的、軟件識(shí)別的峰，需要離子在FT分析器內(nèi)保持完整的、相干的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與類(lèi)似離子共存達(dá)到較長(zhǎng)的時(shí)間，即多毫秒的時(shí)間。所有偏離軌道、亞穩(wěn)的或不相干的離子要么不會(huì)被FT檢測(cè)到，要么會(huì)貢獻(xiàn)于寬闊、平滑的背景信號(hào)，這些信號(hào)可以很容易地被軟件減去。因此，盡管TOF的靈敏度形式上更高，但FT分析器的真實(shí)檢測(cè)極限可能是可比或更低的。

Orbitrap Orbitrap質(zhì)譜是近期新增的分析工具之一，由Alexander Makarov發(fā)明。Orbitrap質(zhì)譜儀由一個(gè)同心的中央電極和一個(gè)桶狀電極組成，并在兩個(gè)電極之間施加靜電場(chǎng)。注入靜電場(chǎng)的離子被兩種力約束；靜電場(chǎng)抵消離心力場(chǎng)，并使離子在中心電極上軸向和徑向運(yùn)動(dòng)。軸向的諧振頻率應(yīng)用于m/z測(cè)量，因?yàn)檫@種振蕩模式與離子能量無(wú)關(guān)。外部電極上的圖像電流用于檢測(cè)。

質(zhì)量分辨率取決于采集時(shí)間（更具體地說(shuō)是諧振次數(shù)），因此更高的質(zhì)量分辨率需要較長(zhǎng)的采集時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)m/z=400處的200,000的質(zhì)量分辨率，這比大多數(shù)TOF儀器高得多(PS:廣告詞而已，m/z=400在抗體分析中并不是一個(gè)典型的質(zhì)荷比，分辨率隨著m/z的上升會(huì)隨之下降，可以見(jiàn)下圖，單方面強(qiáng)調(diào)廣告級(jí)別的分辨率并沒(méi)有太大意義。PS的PS: Thermo打錢(qián)我就刪，當(dāng)然Orbitrap的性能包括易維護(hù)性確實(shí)比TOF好)。

Orbitrap與FTICR的分辨率與m/z的關(guān)系（所有數(shù)據(jù)均顯示為0.76秒掃描）

商業(yè)上，Orbitrap質(zhì)譜儀通過(guò)C-trap與線(xiàn)性離子阱相耦合。C-trap的作用是在進(jìn)入Orbitrap質(zhì)譜儀的入口處電動(dòng)擠壓離子以收斂。線(xiàn)性離子阱和Orbitrap質(zhì)譜儀可以分別或組合使用。例如，在分析模式下，Orbitrap可以執(zhí)行質(zhì)量分析，而離子阱用于接口離子源，連續(xù)傳輸離子并定期將離子引入Orbitrap。兩者可以同時(shí)操作，其中在Orbitrap中執(zhí)行質(zhì)量分析，而在線(xiàn)性離子阱中執(zhí)行MS/MS或MSn碎片實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行質(zhì)量分析。

03結(jié)構(gòu)表征

3.1Middle-UP的結(jié)構(gòu)表征

雖然測(cè)定完整mAbs的質(zhì)量可以給出蛋白質(zhì)的整體表示，但它不能提供任何結(jié)構(gòu)分辨率。要獲得結(jié)構(gòu)分辨信息，必須在質(zhì)量分析之前將蛋白質(zhì)切割成更小的片段。另一種方法，稱(chēng)為“Middle up”方法，包括在質(zhì)譜分析之前將蛋白質(zhì)（mAbs）切割成幾個(gè)大片段。將mAb切割成幾個(gè)大片段的一種方便方法是還原二硫鍵以生成重鏈和輕鏈。對(duì)單個(gè)鏈的質(zhì)量分析可用于確認(rèn)每個(gè)鏈的結(jié)構(gòu)，或者定位每個(gè)單獨(dú)鏈中的變體或修飾。

完全還原所有二硫鍵可以在變性條件下進(jìn)行還原。在沒(méi)有變性劑的情況下，可以選擇性地還原鏈間二硫鍵，使鏈內(nèi)二硫鍵保持完整。這種簡(jiǎn)單的還原方法已被用于確認(rèn)mAb結(jié)構(gòu)，表征抗體結(jié)構(gòu)，確定輕鏈和重鏈上的不同修飾，并檢查重鏈上的糖基化結(jié)構(gòu)。

另一種常見(jiàn)的中間向上方法是在天然條件下用蛋白酶（如木瓜蛋白酶，胃蛋白酶）對(duì)mAbs進(jìn)行處理。對(duì)于許多IgG類(lèi)分子，這些有限消化的切割位點(diǎn)通常在鉸鏈區(qū)附近，生成Fab、F(ab)2和Fc片段。然而，IgG2分子在天然條件下抵抗酶解。這些通過(guò)酶生成的片段還原后會(huì)產(chǎn)生更小的片段。這些片段的質(zhì)量分析提供了比完整mAb質(zhì)量測(cè)量更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。與還原方法類(lèi)似，有限消化方法已被用于確認(rèn)mAb結(jié)構(gòu)，識(shí)別翻譯后或化學(xué)修飾，以及表征抗體結(jié)構(gòu)。

與完整的mAbs相比，這些片段要小得多，因此更容易分析，可能在不太理想的儀器上具有更高的質(zhì)量準(zhǔn)確度。例如，對(duì)于IgG1分子，重鏈質(zhì)量約為51 kDa，輕鏈23 kDa，F(xiàn)c 53 kDa，單鏈Fc 26 kDa，F(xiàn)ab重鏈（Fd）24 kDa，F(xiàn)ab 48 kDa，F(xiàn)(ab)2 96 kDa，相較之下，完整的IgG1質(zhì)量為150 kDa。由于要分析的分子尺寸顯著減小，而且大多數(shù)片段不受糖基化異質(zhì)性影響，因此減少了質(zhì)譜儀的質(zhì)量范圍和分辨率要求。因此，這些片段可以在大多數(shù)儀器上進(jìn)行分析，如四極桿或離子阱，盡管ESI-TOF/Orbitrap仍然是首選方法。

通過(guò)有限消化和/或還原產(chǎn)生的片段通常通過(guò)RP-HPLC分離，并與ESI-MS在線(xiàn)分析。例如，將DTT還原或木瓜蛋白酶消化應(yīng)用于IgG1分子，然后進(jìn)行RP-HPLC/MS分析，以表征和定量諸如焦谷氨酸環(huán)化、脫酰胺化、天冬酸異構(gòu)化和氧化等多種修飾。還原或消化后，RP-HPLC上的亞結(jié)構(gòu)分離良好。圖3顯示了木瓜蛋白酶消化后的IgG1進(jìn)行質(zhì)譜分析的總離子色譜圖。圖中還展示了峰5-7的質(zhì)譜峰。從確定的質(zhì)量可以明顯看出，峰5是具有不同糖基的Fc區(qū)域，峰6是氧化的Fc區(qū)域，峰7是具有去酰胺的Fc區(qū)域。峰1-4被確定為Fab區(qū)域的不同形式，包括焦谷氨酸環(huán)化和脫酰胺（未顯示在圖中）。

圖3

Middle up分析提供了一種簡(jiǎn)單的方法，將結(jié)構(gòu)變化定位到分子的特定區(qū)域。這種方法具有一定程度的結(jié)構(gòu)分辨率，但無(wú)法將變化定位到特定的氨基酸殘基。這種方法對(duì)于確定抗體中結(jié)構(gòu)變化的位置非常有用，但對(duì)于確定結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在哪個(gè)具體氨基酸上，則需要更高分辨率的方法。

3.2 BOTTOM-UP的結(jié)構(gòu)表征

要確認(rèn)蛋白質(zhì)序列或在殘基水平上表征修飾，最常用的技術(shù)是bottom up的方法。在bottom up的方法中，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化成小肽，然后進(jìn)行LC/MS，或更常見(jiàn)的LC/MS/MS分析。蛋白水解與LC/MS/MS分析相結(jié)合，提供了高結(jié)構(gòu)分辨率，但在質(zhì)譜分析中，它通常是最耗材料、耗時(shí)且勞動(dòng)密集的。消化過(guò)程中的假陽(yáng)性，包括易失修飾如琥珀酰亞胺的丟失，以及氨基酸重排，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論，因此需謹(jǐn)慎處理。bottom up廣泛用于確認(rèn)蛋白質(zhì)序列，表征翻譯后、過(guò)程中和貯存中的修飾，以及表征二硫鍵連接。

A.蛋白水解通常在變性條件下對(duì)mAb進(jìn)行還原和烷基化后，使用胰蛋白酶或Lys-C進(jìn)行蛋白水解。其他不太常用的蛋白酶包括Glu-C（V8）和Asp-N?；瘜W(xué)切割方法，如氰酸溴（CNBr）消化，也偶爾會(huì)使用。

以上所有方法通常將蛋白質(zhì)切割成適當(dāng)大小的肽，這些肽在MS/MS實(shí)驗(yàn)中能有效地片段。需要注意的是，在大多數(shù)商用儀器上，大肽（>4 kDa）很難通過(guò)MS/MS表征，而非常小的肽（2-3個(gè)殘基）通常由于在反相柱上的保留不佳而丟失。

B. LC/MS和 LC/MS/MS 在早期，MALDI-TOF儀器廣泛用于測(cè)定從mAb和其他蛋白質(zhì)的蛋白水解產(chǎn)生的肽的質(zhì)量，用于結(jié)構(gòu)確認(rèn)和異構(gòu)體/修飾分析。與ESI-MS相比，MALDI-TOF具有易用性，且耗材和時(shí)間較少的優(yōu)點(diǎn)。然而，由于LC串聯(lián)的便利性和肽鑒定所需的串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)量較好，目前大多數(shù)在mAb上進(jìn)行的自下而上實(shí)驗(yàn)都是在ESI儀器上進(jìn)行的。

在LC/MS/MS肽圖實(shí)驗(yàn)中，困難通常出現(xiàn)在mAb的蛋白水解上。通常需要大量的蛋白質(zhì)材料才能獲得成功的消化。只要實(shí)現(xiàn)完全消化，由于現(xiàn)代儀器的顯著進(jìn)步，MS檢測(cè)的靈敏度通常不是問(wèn)題。因此，大多數(shù)LC/MS/MS肽圖實(shí)驗(yàn)是在小孔徑RP-UPLC柱上進(jìn)行，以獲得最佳的色譜分辨率。

C.二硫鍵確定要確定蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵連接方式，必須在二硫鍵仍然完整的情況下進(jìn)行消化。在普通條件下，單克隆抗體分子非常穩(wěn)定并且難以消化，因此單克隆抗體內(nèi)的二硫鍵連接方式的表征具有挑戰(zhàn)性。成功的消化關(guān)鍵在于在強(qiáng)性變性條件下使單克隆抗體變性，例如6M鹽酸胍和高溫。重要的是，在變性過(guò)程中必須存在烷基化試劑，如碘乙酸（IAA），碘乙酰胺（IAM）或N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM），阻止單克隆抗體中所有存在的自由巰基組來(lái)防止二硫鍵雜化。由于其在較低pH下的活性，通常優(yōu)先使用NEM。消化前必須稀釋變性劑以保留蛋白酶的活性。消化通常使用胰蛋白酶或Lys-C。隨后，一部分樣品會(huì)將使用DTT或者TCEP進(jìn)一步還原二硫鍵，并將LC / MS / MS肽圖與未還原圖進(jìn)行比較以確定二硫鍵連接。靠近鉸鏈區(qū)域的二硫鍵通常使用Edman測(cè)序或者使用TCEP在弱酸性下在NEM or M-biotin存在的條件下部分還原檢測(cè)。

另一個(gè)用于確定mAb中二硫鍵的有用方法是在負(fù)離子模式下通過(guò)LC/MS分析非還原消化物。在負(fù)離子模式下，二硫鍵通常被有效地?cái)嗔?，以顯示通過(guò)二硫鍵連接的鏈。這種方法可以被視為在氣相中的二硫鍵還原。

治療性抗體的二硫鍵結(jié)構(gòu)通常必須經(jīng)過(guò)確認(rèn)，以確?？贵w被正確制備和折疊。大多數(shù)重組的單克隆抗體確實(shí)顯示出與預(yù)期結(jié)構(gòu)一致的二硫鍵結(jié)構(gòu)，除了IgG2分子。有證據(jù)表明，重組和自然發(fā)生的IgG2分子中存在二硫鍵的異質(zhì)體。當(dāng)在非還原條件下消化重組的IgG2分子時(shí)，觀(guān)察到一些后期洗脫的RP-HPLC峰。這些峰的質(zhì)譜分析以及這些峰的收集和還原形式的質(zhì)譜分析表明，它們是二硫鍵連接的肽；所有這些肽都涉及連接到輕鏈恒定區(qū)和/或CH1域的鉸鏈區(qū)。這個(gè)結(jié)果表明，在IgG2分子中存在二硫鍵變異體。這些二硫鍵變異體可以通過(guò)離子交換和反相色譜分離，并且它們?cè)谌颉把簶印杯h(huán)境中相互轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步的研究表明，這些二硫鍵變異形式也存在于人骨髓瘤IgG2和人血清多克隆抗體中。

3.3 TOP-DOWN結(jié)構(gòu)表征

盡管bottom up的方法提供了最多的結(jié)構(gòu)信息，但是它們需要大量的人力，而且常常存在一些問(wèn)題，比如需要消耗大量樣品，消化過(guò)程中可能會(huì)引入人為因素，以及樣品制備需要花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間。對(duì)于數(shù)量或濃度有限的樣品，例如從色譜分離中獲得的微量組分，需要進(jìn)行多次收集和濃縮才能獲得足夠的材料進(jìn)行成功的酶解。在這種情況下，top-down和middle-down成為提供有用序列信息的非?？焖俸头奖愕倪x擇。

Top-down質(zhì)譜法是指將完整分子引入質(zhì)譜儀，而不進(jìn)行溶液中的酶解或化學(xué)分解，并通過(guò)分析分子在質(zhì)譜儀內(nèi)的裂解模式來(lái)獲得結(jié)構(gòu)信息。自上而下的質(zhì)譜法可成功地快速表征小到中等大小的蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)生的高度帶電的碎片離子數(shù)量龐大，因此通常需要高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行top-down的質(zhì)譜分析。通常來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)儀器分辨率來(lái)確定可用自上而下質(zhì)譜法分析的蛋白質(zhì)大小。例如，分辨率為10,000的Q-TOF型儀器應(yīng)該可以為重量達(dá)到10,000 Da的蛋白質(zhì)提供大量的結(jié)構(gòu)信息。對(duì)于更大的蛋白質(zhì)，首選具有更高分辨率的儀器，如傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR MS）或Orbitrap

圖4展示了當(dāng)在Thermo-Fisher LTQ-Orbitrap上分析IgG2分子時(shí)的in-source fragmentation圖譜。除了小的N末端輕鏈碎片和小的N末端和C末端重鏈碎片以及一些內(nèi)部碎片離子外，一個(gè)相當(dāng)引人注目的觀(guān)察結(jié)果是存在一系列大離子，這些離子的存在表明在重鏈的b106到b118離子和輕鏈的b114到b118離子之間存在一些結(jié)構(gòu)信息。這些N末端碎片對(duì)應(yīng)于重鏈和輕鏈的整個(gè)可變區(qū)域。可以對(duì)這些b離子進(jìn)行MS/MS以獲得有關(guān)可變區(qū)域更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。

圖4：一種IgG2分子in-source fragmentation質(zhì)譜圖。完整的圖譜顯示在頂部。底部顯示了從m/z 1,500到1,850的圖譜。主要的碎片離子用帶電荷的b或y離子標(biāo)記。前綴H代表重鏈，L代表輕鏈。

Top-down的質(zhì)譜法消耗的材料很少，可以在很短的時(shí)間內(nèi)提供有用的結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)與在線(xiàn)液相色譜/質(zhì)譜法相結(jié)合時(shí)，in-source fragmentation的完整mAb可以在沒(méi)有任何樣品制備的情況下提供有用的可變區(qū)域以及末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)信息。

自上而下的質(zhì)譜法用于大蛋白質(zhì)（如mAb）的主要缺點(diǎn)是通常具有有限的結(jié)構(gòu)分辨率。對(duì)于IgG1和IgG2分子，只能獲得可變區(qū)域和末端附近的信息。在大多數(shù)情況下，機(jī)緣巧合仍然是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。如果感興趣的修飾位點(diǎn)位于富含序列信息的區(qū)域，則可以準(zhǔn)確地確定修飾位點(diǎn)。在其他情況下，如果修飾位點(diǎn)位于序列信息較少的區(qū)域，則可以將修飾位點(diǎn)分配給蛋白質(zhì)的一個(gè)較大的片段，但無(wú)法指定特定的氨基酸殘基。

3.4 MIDDLE-DOWN結(jié)構(gòu)表征

Middle down可能是解決自top down中結(jié)構(gòu)分辨率有限問(wèn)題的一種有價(jià)值的替代方法。在middle down中，蛋白質(zhì)首先通過(guò)還原二硫鍵或者有限的蛋白酶水解作為中間步驟分成幾個(gè)大片段，然后再被引入質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS分析。與top down相比，middle down可以在一些有限的樣品制備情況下潛在地提高結(jié)構(gòu)分辨率。由于中等質(zhì)量實(shí)驗(yàn)中所采用的還原二硫鍵是化學(xué)反應(yīng)，可以使用大量的化學(xué)試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此它不像酶反應(yīng)那樣有樣品濃度的要求，因?yàn)槊阜磻?yīng)通常不使用大量的酶（貴貴貴貴啊）。因此，對(duì)于稀釋的少量樣品，middle down實(shí)驗(yàn)比top down更有優(yōu)勢(shì)。

圖5顯示了一種IgG2分子的輕鏈和重鏈的CID MS/MS譜圖，該譜圖是在Thermo LTQ-Orbitrap上獲得的。Orbitrap的超高分辨率和質(zhì)量精度可確保片段離子的準(zhǔn)確鑒定。通過(guò)MassAnalyzer的分配和手動(dòng)驗(yàn)證，根據(jù)準(zhǔn)確測(cè)定的質(zhì)量、同位素模式和一些片段化規(guī)則，大多數(shù)片段離子可以分配為b、y或其他片段。根據(jù)這些分配，輕鏈中213個(gè)肽鍵中有59個(gè)被切割，重鏈中447個(gè)肽鍵中有67個(gè)被切割；這些數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于輕鏈的平均結(jié)構(gòu)分辨率（通過(guò)將肽鍵的總數(shù)除以被切割的肽鍵數(shù)來(lái)計(jì)算兩個(gè)切割位點(diǎn)之間的平均殘基數(shù)）為3.6個(gè)殘基，重鏈為6.7個(gè)殘基。

圖5

04未來(lái)展望直到最近，幾乎所有的mAb結(jié)構(gòu)表征都是通過(guò)bottom-up方法實(shí)現(xiàn)的。雖然bottom-up方法越來(lái)越成熟，但是top-down和middle-down方法仍處于發(fā)展初期。然而，top-down/middle-down方法的優(yōu)點(diǎn)，如最小樣品操作和快速反應(yīng)時(shí)間，使得這些技術(shù)非常有吸引力。雖然并不是所有的結(jié)構(gòu)問(wèn)題都能用top-down或middle-down方法解決，但許多問(wèn)題可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)解決，而不是像"up"方法一樣需要幾天時(shí)間。top-down/middle-down方法沒(méi)有被廣泛接受的主要原因之一是它們需要高分辨率的儀器。然而，現(xiàn)代高分辨率儀器，如FT-ICR和Orbitrap，正在變得更加用戶(hù)友好，并且這些高端儀器正逐漸放到工業(yè)MS用戶(hù)手中。 當(dāng)表征蛋白質(zhì)異構(gòu)體或修飾時(shí)，"bottom-up"方法將逐漸成為輔助方法，只有在"top-down"或"middle-down"實(shí)驗(yàn)失敗時(shí)才會(huì)使用。電子俘獲解離（ECD）在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的"up"和"down"方法中具有巨大潛力。然而，由于使用難度大，需要FT-ICR儀器，因此它并沒(méi)有成為蛋白質(zhì)化學(xué)家的主要工具。然而，最近開(kāi)發(fā)的電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于離子阱儀器中。此外，在Orbitrap上實(shí)現(xiàn)ETD使得對(duì)更大的肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析成為可能，并且對(duì)于middle-down實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)成為了理想的選擇。

參考文獻(xiàn)：Roman A. Zubarev and Alexander Makarov.Orbitrap Mass Spectrometry. doi.org/10.1021/ac4001223

Zhongqi Zhang, Hai Pan, and Xiaoyu Chen. Mass spectrometry for structural characterization of therapeutic antibodies. DOI 10.1002/mas.20190